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全自动WB工作站的操作步骤介绍

发布日期: 2023-08-23
浏览人气: 121
  免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
  由于抗体仅与目标蛋白质结合,因此一般只能看到一条清晰的带,条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度,可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度,Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。
  全自动WB工作站操作步骤:
  1.准备样品
  1)制冰,准备冰盒。
  2)配制细胞裂解液:根据细胞数量确定所需裂解液:50ul/六孔板一孔。
  裂解液配方:100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF
  3)按实验需要准备好细胞:去掉培养基,1×PBS洗3次(去掉培养基中的血清),每个孔(6孔板)加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中,置于冰上20min,振荡混合后,再置冰上10min。
  4)12,000g,4℃离心15min,收集上清至另一1.5ml管。
  5)取2.5ul样品加22.5ul三蒸水稀释,用于BCA法测蛋白浓度。
  6)其余样品加5×Loading Buffer(按2.5mlBuffer/10ml蛋白)用95℃煮10分钟,期间振荡一次。
  7)直接上样跑胶或者分装-80°C长期保存。
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